Тез. докл. Международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация” 24-26 мая 2011г., г. Пущино , том 1, с. 291-295

ПАТТЕРН ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ СЕРОТОНИНА В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ XENOPUS LAEVIS

Никишин Д.А.¹, Кремнёв С.В.², Шмуклер Ю.Б.¹

¹Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

²Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Донервные функции веществ, описанных как нейротрансмиттеры (серотонин, ацетилхолин, адреналин, дофамин), впервые были показаны более 50 лет назад [1,2]. С тех пор стало ясно, что эти вещества функционально активны в течение всего онтогенеза, от гаметогенеза до постэмбрионального развития, а нейротрансмиттерная роль этих веществ является вторичной. В частности, серотонин вовлечен в самые разнообразные процессы индивидуального развития, от оогенеза и оплодотворения до морфогенетических процессов и таких явлений постэмбрионального периода, как метаморфоз [3,4]. Кроме того, известно, что серотонин влияет на такие функции клетки, как ресничная моторика [5] и состояние цитоскелета [6,7]. Серотонин обнаружен в яйцеклетках и ранних зародышах всех исследованных на этот предмет животных [8]. Показано, что материнский серотонин, накопленный в яйцеклетке, критически необходим для нормального морфогенеза плода у мышей [9]. Кроме того, имеются многочисленные экспериментальные данные, полученные физиологическими методами и демонстрирующие, что серотонин участвует в таких процессах раннего развития, как дробление [10], межбластомерные взаимодействия [11], гаструляция [12] и установление лево-правой асимметрии [13]. Долгое время описание функций нейротрансмиттеров в эмбриогенезе ограничивалось физиологическими методами. Лишь в последнее время появились исследования трансмиттерных систем в донервном эмбриогенезе, выполненные с использованием молекулярно-биологических методов, но они до сих пор остаются единичными [14,15]. Данная работа посвящена исследованию экспрессии рецепторов и транспортёров серотонина в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis, и является частью систематического исследования донервных трансмиттерных систем в раннем развитии животных.

Методом обратно-транскрипционной ПЦР (ОТ-ПЦР) мы исследовали паттерн экспрессии рецепторов серотонина HTR1A, HTR2B, HTR2C, HTR3A, HTR4 и HTR7. В качестве внутреннего контроля использовали ген орнитиндекарбоксилазы (ODC). ОТ-ПЦР проводили на тотальной РНК, выделенной из неоплодотворённых ооцитов и эмбрионов на стадиях двух бластомеров (стадия 2), средней бластулы (стадия 8), поздней бластулы (стадия 9), ранней гаструлы (стадия 10), нейрулы (стадия 16) и вылупления (стадия 33-35), в качестве положительного контроля были получены пробы головастиков и мозга взрослых лягушек, стадии определяли по таблицам нормального развития [16]. Результаты преставлены на рис.1. ОТ-ПЦР анализ показал, что HTR1A, HTR2B, HTR3A и HTR4  не экспрессируются на ранних стадиях развития X. laevis. HTR1A выявляется начиная с нейрулы, также как HTR3A и HTR4. HTR2B впервые выявляется только на стадии вылупления. HTR2C экспрессируется на донервных стадиях, выявляется начиная с зиготы, до стадии 10, на стадиях нейрулы и вылупления не выявляется. Вновь HTR2C начинает экспрессироваться на стадии головастика. HTR7 экспрессируется непрерывно на всех стадиях развития. Все рецепторы серотонина экспрессируются во взрослом мозге, кроме HTR3A. ПЦР-продукты HTR2C и HTR7, полученные из проб ооцитов выделены и отсеквенированы. Полученные нуклеотидные последовательности соответствуют мРНК HTR2C и HTR7 X. laevis.

Экспрессию рецепторов HTR2C и HTR7 мы количественно исследовали методом ПЦР в реальном времени, результаты представлены на рис.2. Оба гена экспрессируются на ранних стадиях развития, что говорит об их материнском происхождении, поэтому расчёт степени экспрессии производили относительно стадии 2 бластомеров, т. е. относительно материнской экспрессии гена. Экспрессия HTR2C максимальна на стадии 2 бластомеров, после чего постепенно снижается. К стадии 10 степень экспрессии составляет чуть больше 10%, на стадиях нейрулы и вылупления – менее 3%. HTR7 экспрессируется более или менее равномерно на протяжении всего развития, лишь на стадии вылупления его экспрессия уменьшается примерно в три раза.

Зиготический геном Xenopus включается на стадии средней бластулы (стадия 8), когда происходит так называемый среднебластульный переход и в зародыше начинается транскрипция. Раннее развитие происходит за счёт транскриптов, входящих в состав материнской мРНК, накопленных во время оогенеза [17]. Мы показали, что в состав материнского пула мРНК входят транскрипты по крайней мере двух из семи типов серотониновых рецепторов. Во-первых, начиная с яйцеклетки и по крайней мере до гаструляции экспрессируется HTR2C. На стадиях нейрулы и вылупления экспрессия настолько мала, что не выявляется методом ОТ-ПЦР при 35 циклах амплификации, а на стадии головастика экспрессия HTR2C появляется снова. То, что максимум экспрессии HTR2C приходится на самые ранние стадии развития, говорит о его участии в наиболее ранних процессах эмбриогенеза. Показано, что ритансерин, антагонист HTR2A и HTR2C, индуцирует растворение зародышевого пузырька в незрелых ооцитах [18]. Возможно, что HTR2C участвует в регуляции созревания яйцеклетки. Второй рецептор серотонина, экспрессирующийся на ранних стадиях развития – HTR7. Он выявляется на протяжении всего эмбрионального развития. Есть данные, свидетельствующие о влиянии HTR7 на процесс созревания ооцитов X. laevis [18]. Однако, судя по динамике экспрессии в эмбриогенезе, можно предполагать о какой-то универсальной регуляторной роли этого рецептора в развитии. На ранних стадиях не выявляется экспрессия HTR1A, HTR2B, HTR3A, HTR4. Для HTR1A показано участие в нейрогенезе, для HTR2B – в черепно-лицевом морфогенезе, формировании челюстного сустава и морфогенезе глаза у Xenopus [19]. Эти процессы происходят на поздних стадиях развития. Что касается раннего эмбриогенеза, то физиологическими методами показано, что серотонин участвует в установлении лево-правой асимметрии X. laevis. Предполагается, что эта функция опосредована рецепторами серотонина HTR3 и HTR4 [13]. Однако, наши данные чётко свидетельствуют о том, что транскрипты HTR3A и HTR4 не входят в состав материнской мРНК и появляются только после гаструляции. HTR3 является лиганд-зависимым ионным каналом, состоящим из пяти субъединиц, которых существует несколько типов, причём функциональный третий рецептор обязательно имеет в своем составе субъединицу HTR3A. Следовательно, отсутствие экспрессии HTR3A говорит об отсутствии функциональных третьих рецепторов. Это же справедливо и для мономерного HTR4. Не исключено, что эти рецепторы нарабатываются во время оогенеза и представлены в эмбрионах в виде белка.

Таким образом мы показали, что на ранних стадиях развития Xenopus экспрессируются по крайней мере два рецептора серотонина. Существенно, что эти рецепторы сопряжены с разными системами вторичных мессенджеров. HTR2C через G_q активирует фосфолипазу C, поэтому его взаимодействие с серотонином приводит к повышению внутриклеточного Ca²⁺. При этом, кроме всего прочего, активация кальций-зависимой протеинкиназы С имеет множество эффектов на цитоскелет [20], которые могут опосредовать влияние серотонина на деления дробления. Связавшийся с лигандом HTR7 через G_s активирует аденилатциклазу, что приводит к повышению уровня цАМФ. Этот сигнал также имеет множество последствий – известны эффекты цАМФ на цитоскелет [21], и даже на закладку осевого комплекса [22]. Стоит отметить, что мы показали экспрессию мРНК этих рецепторов, что не означает экспрессию самого белка. Тем более, что само по себе присутствие транскрипта в составе материнской мРНК не гарантирует, что он будет транслирован на ранних стадиях. Однако, динамика экспрессии этих генов, а так же известные эфекты серотонина в раннем развитии, позволяют предполагать, что эти рецепторы функционально активны в этот период эмбриогенеза. Известно, что в ранних эмбрионах Xenopus присутствует серотонин. Его концентрация серотонина падает во время гаструляции и вновь увеличивается уже на нейральных стадиях развития [13]. Такая динамика указывает на то, что серотонин функционально активен именно в донервном развитии. Наши результаты показали, что эти функции могут быть опосредованы через экспрессирующиеся на ранних стадиях развития рецепторы серотонина HTR2C и HTR7. Стоит отметить, что серотонергическая система не является единственной возможной сигнальной системой, функционирующей в раннем эмбриогенезе Xenopus. Известно, что в ранних эмбрионах лягушки есть адреналин и норадреналин и экспрессируется адренорецептор ?₁ [23]. Это демонстрирует множественность трансмиттерных систем в эмриогенезе, постулированную Бузниковым [2,8]. Данная работа является первой частью систематического исследования трансмиттерных систем в раннем эмбриогенезе.

Работа поддержана грантом РФФИ № 08-04-00144.

ЛИТЕРАТУРА

1. Манухин Б.Н., Бузников Г.А. // Физиологический журнал СССР. (1960) (9): 1160-3.

2. Бузников Г.А. Низкомолекулярные регуляторы зародышевого развития. М.: Наука. (1967).

3. Turlejski K. // Acta Neurobiol. Exp. (1996) 56 (2): 619-36.

4. Barlow L.A., Truman J.W. // J. Neurobiol. (1992) 23 (7): 829-44.

5. Doran S.A., Koss R., Tran C.H., Christopher K.J., Gallin W.J., Goldberg J.I. // J. Exp. Biol. (2004) 207 (8): 1415-29.

6. Small D.H., Wurtman R.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1984) 81 (3): 959-63.

7. Бузников Г.А.,  Григорьев Н.Г. // Ж. эвол. биохим. физиол. (1990) (26): 614-22.

8. Бузников Г.А. Нейротрансмиттеры в эмбриогенезе. М.: Наука. (1987).

9. Cote F., Fligny C., Bayard E., Launay J.-M., Gershon M.D., Mallet J., Vodjdani G. // Proc. Nat. Acad. Sc. U. S. (2007) 104 (1): 329–34.

10. Buznikov G.A., Nikitina L.A., Raki? L.M., Milosevi? I., Bezuglov V.V., Lauder J.M., Slotkin T.A. // Brain Res. Bull. (2007) 74 (4): 221-31.

11. Shmukler Y.B., Silvestre F., Tosti E. // Zygote. (2008) 16 (1): 79-86.

12. Мартынова Л.Е. // Онтогенез. (1981) 12 (3): 310–4.

13. Fukumoto T., Kema I.P., Levin M. // Curr. Biol. (2005) 15 (9): 794-803.

14. Hamdan F.F., Ungrin M.D., Abramovitz M., Ribeiro P. // J. Neurochem. (1999) 72 (4): 1372-83.

15. Dube F., Amireault P. // Life Sci. (2007) 81 (25-26): 1627-37.

16. Nieuwkoop P.D., Faber J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). North Holland, Amsterdam. (1967).

17. Heasman J. // Development. (2006) 133 (7): 1205-17.

18. Sheng Y., Wang L., Liu X.S., Montplaisir V., Tiberi M., Baltz J.M., Liu X.J. // J Cell Physiol. (2005) 202 (3): 777-86.

19. Reisoli E., De Lucchini S., Nardi I., Ori M. // Development. (2010) 137 (17): 2927-37.

20. Larsson C. // Cell Signal. (2006) 18 (3): 276-84.

21. Howe A.K. // Biochim. Biophys. Acta. (2004) 1692 (2-3): 159-74.

22. Kim M.J., Han J.K. // Mech Dev. (1999) 89 (1-2): 55-64.

23. Devic E., Paquereau L., Steinberg R., Caput D., Audigier Y. // FEBS Lett. (1997) 417 (2): 184-90.